生物实验报告

西安交通大学实验报告

实验一：质粒DNA的提取及酶切

实验目的

从大肠杆菌中提取质粒DNA，测定质粒浓度；
掌握碱裂解法提取质粒的基本原理和实验技术方法；
掌握紫外分光光度法测定核酸浓度和纯度的原理和方法。

实验原理

提取质粒：

载体：能够携带目的基因进入宿主细胞进行繁殖和表达的工具。

在宿主细胞中能保存下来并具有一定拷贝数，对宿主细胞无害，不影响宿主细胞正常生命活动。
有多克隆位点，即限制性核酸内切酶酶切位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。
有复制起始位点，能够独立复制，通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。
有标记基因，便于进行筛选。如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因或LacZ基因。
表达载体还包括表达元件（如启动子、核糖体结合位点、终止子等），保证目的基因能够正常表达。

碱裂解法提取质粒DNA（柱离心纯化法）：

高碱+SDS：细菌细胞壁破裂，内容物释放：

细菌染色体DNA断裂成不同长度的线性双链片段DNA；
线性双链DNA片段中氢键断裂，双链解离变性；
质粒DNA不发生断裂，仍保持双链闭合环状；
质粒DNA的两条链并不完全分离。

高酸中和至中性：

变性的细菌染色体DNA及变性的蛋白质及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶沉淀；质粒DNA恢复天然构型，溶解于上清液中；

纯化：RNA酶消化除去RNA，硅胶柱离心纯化质粒DNA。

硅胶柱法：

高盐环境下，DNA能与二氧化硅结合；低盐环境下，DNA能与二氧化硅分离；

玻璃的主要成分：二氧化硅；硅胶膜：极细的玻璃纤维堆叠很多层。

原理：

利用共价闭合环状质粒DNA与细菌线状染色体DNA片段在拓扑学上的差异进行分离。

溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成:(保护、缓冲)

葡萄糖的作用是增加溶液的粘度减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒（保护作用）
EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）
Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）

溶液Ⅱ：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成（裂解、变性）

SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）
NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）

溶液Ⅲ：HAc和KAc组成的高盐溶液（复性，分离）

HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
Kac会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。

朗伯-比尔定律（Lamber-Beer Law）

A=-\lg⁡(\frac{I}{I_0})=\lg⁡(\frac{1}{T})=KCL

其中A为吸光度；T为透光率；K为摩尔吸收系数，与吸收物质的性质及入射光的波长有关；C为吸光物质的浓度；L为溶液厚度

紫外分光光度法测定核酸的浓度：

根据Lambert-Beer定律，物质的吸光度值与其浓度呈正比；

核酸溶液在260nm具有最大吸光度值；可以根据核酸在260nm的光吸收值来测定核酸的浓度；

一个吸光度值（A）相当于：50ug/ml双螺旋DNA，40ug/ml单链DNA或RNA，20ug/ml寡核苷酸

核酸样品纯度的测定：通过测定不同波长下的吸光度值，来测定核酸的纯度

230nm：胍盐、苯氧基离子等常用于核酸制备的化合物在230nm具有强光吸收；

280nm：芳香族氨基酸在280nm有强光吸收，因此常用260nm与280nm的吸光度比值来检测核酸中是否有蛋白质污染

OD260/OD280=1.7~2.0：表明蛋白质污染较少

OD260/OD230>2：表明核酸较纯

320nm：此波长下的光吸收指示溶液的浊度，可用于可引起溶液浑浊的物质污染的检测

酶切：

核酸酶：水解切断核苷酸链的磷酸二酯键，作用于磷酸二酯键的P-O 位置。
三种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型

Ⅰ型和Ⅲ型限制性内切酶：切割位点的序列不固定，不宜用于基因克隆。

Ⅱ型限制酶：特异性识别核苷酸序列并在识别序列内特定位点切割DNA，广泛用于DNA分子克隆。

选择合适的双酶切体系

实验记录

提取：

实验材料：

大肠杆菌菌液：已转入质粒pUC19，37℃过夜培养（14h）。

氨苄青霉素母液：配成 50mg/ml水溶液，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。使用时稀释1000倍。

质粒小提试剂盒（TIANGEN, DP103，50次）：

溶液Solution Ⅰ（P1）（需加入RNaseA），溶液Solution Ⅱ（P2），溶液Solution Ⅲ（P3），平衡液BL（Buffer BL），漂洗液PW（加入无水乙醇）（Buffer PW），洗脱缓冲液EB（Elution Buffer），去蛋白液PD（Buffer PD），RNase A，吸附柱CP3，收集管（2ml）。

实验仪器：1ml、200μl、10μl移液器每组一套；三种规格枪头，每组1套；1.5mlEP管（灭菌）； EP管架；离心机；超微量分光光度计；涡旋振荡器；水浴锅。

实验步骤：

柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500pl的平衡液BL，12，000rpm（—13，400×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
取1—5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12，000rpm（～13，400×g）离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
向留有菌体沉淀的离心管中加入250uI溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6—8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
向离心管中加入350 μl溶液P3，立即用枪上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400 × g)离心10分钟，此时在离心管底形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400 × g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
可选步骤：向吸附柱CP3中加入500 μl去蛋白液PD，12,000 rpm (~13,400 × g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，降解质粒DNA，推荐采用此步骤。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可略。
向吸附柱CP3中加入600 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400 × g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
重复操作步骤8。
将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm (~13,400 × g)离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底干吸附材料中残余的漂洗液。
将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置滴加50-100 μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000 rpm (~13,400 × g)离心2分钟将洗脱液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序、需使用去离子水洗脱液，并保持其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm (~13,400 × g)离心2分钟，将洗脱液收集到离心管中。

酶切：

每组取1个PCR管，管盖和管壁做好标记，按上表配置酶切体系。

结果分析

核酸浓度 $29.0ng/\mu l$ 在正常范围内稍低；

$\frac{A260}{A280}=1.82$ :在正常范围1.7-2.0内

$\frac{A260}{A230}=0.69$ :核酸纯度较低

偏差分析

浓度偏低：

溶液P1加入量偏少，质粒被破坏
溶液3加入量偏少导致部分质粒进入沉淀
步骤6中为防止吸入沉淀导致污染，并未完全吸出全部上清液，导致DNA在该步骤中流失
溶液碱性不够强，硅胶柱吸附不完全，导致部分DNA在实验过程中流失
初始菌液在转移过程中存在部分损耗

纯度较低：

加入的碱浓度不够
蛋白质污染较多导致核酸纯度偏低
步骤4中未充分搅拌导致菌块未充分裂解，后续提纯步骤效果不好

第二个问题见实验二的分析。

实验二、聚合酶链式反应及琼脂糖凝胶电泳

实验目的

1.利用PCR技术扩增目的基因序列；

2.掌握PCR技术的原理和操作方法；

3.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。

实验原理

PCR(Polymerase chain reaction)-聚合酶链式反应是一种特异性体外扩增 DNA 的技术，需要模板、引物、dNTPs，DNA聚合酶和反应缓冲液等。

模板：包含目的DNA片段，如基因组DNA、质粒DNA等

引物：能与模板互补的单链寡核苷酸序列，包括上下游2条

四种三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）：合成目的DNA片段的原料

DNA聚合酶：催化目的DNA片段合成

反应缓冲液：提供反应适宜条件，如保证酶的活性和反应特异性，Tris-HCl提供合适的pH

PCR分为高温变性、低温退火、中温延伸三个阶段：

琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是线性的多聚物，基本结构：β-D-半乳糖和3,6-内醚-L-半乳糖交替连接成长链；
溶解之后再形成的琼脂糖凝胶，形成多孔的网状结构，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；
DNA分子的泳动速度与其分子量的对数成反比。
DNA 分子的泳动速度也与其拓扑构象有关，成环DNA分子一般快于开环DNA分子。
不同浓度的琼脂糖凝胶适合分离不同大小的DNA片段。
琼脂糖凝胶浓度越高，适合分离的DNA片段越小

实验记录

样品：

模板：DNA（或质粒DNA），-20℃储存

引物：

P1：5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’

P3：5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’

其他试剂：

Taq酶，dNTP Mixture，10 × PCR Buffer (Mg2+ plus)
1*TAE 电泳缓冲液，6×Loading Buffer，10×Loading Buffer，DL5000 Marker，Supercoiled Marker，EB替代物（Gel Red），琼脂糖

仪器：
PCR仪，移液枪，PCR管，10 $\mu l$ 枪头，100 $\mu l$ 枪头，离心机，电泳仪，水平电泳槽，天平，微波炉，药匙，棉线手套，凝胶成像仪，三角烧瓶，锡箔纸，称量纸

步骤：

取PCR管1个，做好标记，按顺序加入表中PCR反应体系各组分，混匀。将管壁液滴甩至管底，放入PCR仪。
按下表设置PCR反应程序，将加好样品的PCR管混匀离心后放入PCR仪，进行DNA的扩增。

琼脂糖凝胶：

相邻4个小组的8位同学共同配制2块凝胶， 1-2块凝胶使用一套电泳设备。
胶槽安装：胶板放入胶槽中，插入11孔的梳子；
凝胶液的制备（1%）：称取0.8g琼脂糖，置于200ml 三角烧瓶中，加入80ml 1×TAE
铝箔封口扎小洞防止蒸发，放入微波炉加热至琼脂糖全部熔化。冷却至50～600C时加入8μl Gel Red混匀（全程戴好手套）；
制胶：将胶液倒入胶槽中（40ml/胶槽），待完全凝固后拔出梳子。电泳及拍照观察：
上样准备：取几个EP管，做好标记
质粒DNA、酶切产物：取18μl，加入2μl 10×loading buffer混匀，共20μl
PCR产物：取9μl，加入1μl 10×loading buffer混匀，共10μl
上样：
Marker：5μl
每组3个样品：1个质粒DNA，1个酶切产物，1个PCR产物
电泳：
160V，30-40min
观察：在凝胶成像仪中观察DNA电泳条带并拍照，将照片拷走分析。